Szanowny Użytkowniku,

25 maja 2018 roku zaczyna obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r. w sprawie ochrony osób fizycznych w związku z przetwarzaniem danych osobowych i w sprawie swobodnego przepływu takich danych oraz uchylenia dyrektywy 95/46/WE (określane jako „RODO”, „ORODO”, „GDPR” lub „Ogólne Rozporządzenie o Ochronie Danych”). W związku z tym informujemy, że wprowadziliśmy zmiany w Regulaminie Serwisu i Polityce Prywatności. Prosimy o poświęcenie kilku minut, aby się z nimi zapoznać. Możliwe jest to tutaj.

Rozumiem

Neuroscience: technologia i myszy

Neuroscience: technologia i myszy

31.07.2014
Czyta się kilka minut
Ile zadziwiających kroków eksperymentalnych muszą poczynić neuronaukowcy, by móc ogłosić, że jakiś region lub struktura mózgu odpowiada za jakąś funkcję? Więcej niż ktoś nieobeznany z tą dziedziną mógłby sobie wyobrazić. Czy po drodze nie zbaczają na manowce nauki?
Myszy laboratoryjne (Wikimedia Commons)
Z

Z roku na rok powiększa się zasób narzędzi neuronauk. Opisywane w tym artykule badania* są typowe dla obecnej fazy rozwoju tej grupy dyscyplin. Na jednym przykładzie chciałbym przybliżyć niektóre „sztuczki” neuroscience i pokazać, jak działa ona w praktyce. Tłem dla naszych filozoficzno-technologicznych rozważań będzie opis pewnego zjawiska neurologicznego: manipulacji tkanką nerwową myszy w celu precyzyjnego kontrolowania poziomu agresji wobec potomstwa.

Myszy: oseski, dziewice, matki i ojcowie

Naszymi bohaterami są myszy, które ze względu na procedurę eksperymentalną podzielono na 4 kategorie: myszy młodsze niż 4 tygodnie (mniej więcej w tym momencie przestają odżywiać się mlekiem matki) – będą tu określane jako „oseski”. Druga kategoria to młode myszy, które nie zdążyły się jeszcze rozmnożyć; z całej palety bardziej czy mniej finezyjnych określeń najlepsze będzie chyba po prostu słowo „dziewica”. Myszy, które dorobiły się już potomstwa, to „matki” i „ojcowie”.

Sprawa przedstawia się następująco. Mysie samice-dziewice, matki i ojcowie wykazują odruchy opiekuńcze wobec osesków. Z kolei samce-dziewice traktują oseski obojętnie lub agresywnie, jednak kiedy tylko staną się ojcami, odruchy agresywne wyciszają się, pojawiają się natomiast odruchy opiekuńcze. Stan ten trwa dopóki oseski karmione są przez matki (czyli dopóki zaliczyć je można do osesków). Co ciekawe, odruchy opiekuńcze można również „wytrenować” poprzez zmuszenie samców-dziewic do przebywania w towarzystwie osesków, oczywiście w kontrolowanych warunkach, aby nie doszło do tragedii. Wiadomo, że decydującym czynnikiem decyzyjnym jest zapach, ponieważ upośledzenie zmysłu węchu – a zwłaszcza narządu Jacobsona, kluczowego organu, za pomocą którego myszy wykrywają feromony – powoduje kompletną dezorientację samic i samców w kwestii opieki nad oseskami.

Autorzy omawianego artykułu postanowili zbadać, który obszar mózgu odpowiedzialny jest za działanie regulacyjne, które sprawia, że ten sam bodziec zapachowy powoduje odmienną reakcję u myszy na różnym stadium życia. Uwaga – procedura była dość drastyczna.

Rzut oka na mózg

Myszy pochodzące ze ściśle określonej linii genetycznej trzyma się typowo w pojemnikach o wymiarach 47x23x20 cm wyłożonych suchą ściółką. Temperatura utrzymywana jest w okolicach 22°C, a oświetlenie klatek przygaszane jest na noc. Jedzenie i woda dostępne są bez ograniczeń. Dorosłym myszom daje się zwykle ok. 2 tygodni na aklimatyzację w laboratorium przed rozpoczęciem badań. Ponieważ w tym eksperymencie badano relacje społeczne, dorosłym myszom pozwalano regularnie na bezpośredni kontakt z innymi osobnikami. Wszystkie oseski spędzały czas z matkami.

W przypadku tak mikroskopijnych obiektów, jak poszczególne obszary mysiego mózgu (często mniejsze od milimetra), a zwłaszcza podczas konieczności badania stanu mózgu w momencie wykonywania określonych czynności, nie ma mowy o metodach obrazowania na odległość. Odpadają wszelkiego typu rezonanse i tomografie. W ściśle określonym momencie – np. tuż po chwili, kiedy samiec-dziewica zaczął wykazywać zachowania agresywne wobec oseska – wstrzykuje się mu silny środek znieczulający w dawce powodującej śmierć (typowo jest to ketamina, stosowana powszechnie w weterynarii nawet do usypiania koni), po czym podaje się dożylnie dużą dawkę koktajlu chemicznego, którego zadaniem jest najpierw powstrzymanie krzepnięcia (świetnie sprawdza się stara dobra heparyna), a następnie rozkładu tkanek (i tu również króluje sprawdzona klasyka: formaldehyd). Po dwóch dniach silnie schłodzone (4° C) myszy wysyła się do badania.

Wibratom to ultra-ostra wibrująca gilotyna, która jest w stanie ścinać z badanej próbki plasterki o grubości kilkudziesięciu mikrometrów – czyli kilkadziesiąt plasterków na milimetr. W przypadku opisywanego tu badania wykonano wibratomem serię cięć mózgu dobranych tak, żeby uzyskać jak najlepszy wgląd w kilka wstępnie jego wyselekcjonowanych obszarów, w tym ciało migdałowate i podwzgórze. Na tym etapie plasterki-preparaty są ponadto nasączane substancjami mającymi uwidocznić pożądane zjawisko. Ponieważ naukowców interesowała aktywność mózgu w momencie śmierci, a sam sygnał elektrochemiczny znika natychmiast po śmierci, badano obecność w komórkach neuronalnych białka c-Fos, które jest wydzielane przez neurony w trakcie przewodzenia przez nie sygnałów. Następnie preparaty poddaje się różnym kąpielom utrwalającym i barwiącym i w końcu ogląda pod mikroskopem.

W przypadku cytowanego badania okazało się, że u wszelkiej płci i wieku myszy opiekuńczych aktywuje się w momencie opieki pewien ściśle określony fragment mózgu – przyśrodkowe pole przedwzrokowe (ang. median preoptic area, MPOA), będące częścią podwzgórza. U agresywnie zachowujących się samców-dziewic obszar ten był nieaktywny.

myszy_1_3

Ryc. 1. Anatomia mysiej głowy z zaznaczeniem tego przekroju czołowego, na którym widoczne jest pole przedwzrokowe. Ilustracje po prawej pochodzą z cytowanego artykułu i pokazują już aktywność przyśrodkowej części pola przedwzrokowego w trzech wariantach. Ilustracja własna. Źródła: Wikimedia (http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Rostral_migratory_stream_mouse_cropped.jpg), rysunek nieznacznie zmieniony; The Mouse Brain Library, licencja public domain (http://www.mbl.org/atlas170/atlas170_frame.html); Wu i in. 2014, Fig. 2a-c, nieznacznie zmodyfikowane, użytek dozwolony (www.nature.com/nature/journal/v509/n7500/full/nature13307.html).

Zabawa przyciskami: wyłącznik

Gdy tylko okazało się, że istnieje pewien „podejrzany” obszar mózgu, natychmiast pojawiła się pokusa, żeby sprawdzić jego rolę w zachowaniu wobec osesków bardziej… bezpośrednio. Samo aktywowanie się określonych neuronów w określonych momentach to jedynie korelacja. Żeby sprawdzić zależności przyczynowe, należałoby spróbować „wyłączyć” te neurony – co powinno spowodować zachowania agresywne. Rzecz w tym, że PPP to złożony obszar anatomiczny pełniący szereg funkcji, przez co „wyłączenie go” w całości przyniosłoby skutek śmiertelny. Po kolejnej rundzie badań szczęśliwie udało się zidentyfikować subpopulację neuronów MPOA, które wykazywały wzmożoną aktywność wyłącznie w momencie zajmowania się przez dorosłego osobnika oseskami. Były to rozsiane po całym o obszarze MPOA neurony produkujące związek chemiczny o nazwie galanina, określane więc jako MPOA-Gal+. „Plusik” dodany po trzyliterowej nazwie związku chemicznego lub genu oznacza zwyczajowo w biotechnologii, że w preparacie wykrywa się pochodzący od nich sygnał.

I oto nadciąga genetyka. Naukowcy wyhodowali populację myszy, u których pod gen kodujący galaninę „podczepiony” został gen kodujący niezwiązane z nią białko, rekombinazę Cre. Gdy tylko któraś z komórek organizmu takiej transgenicznej myszy inicjowała produkcję galaniny, przy okazji produkowała również cząsteczki białka Cre – stąd szczep ów można skrótowo określać jako Gal-Cre. Mimo że jest to stosowana od dekad metoda, badacze na wszelki sprawdzili jej skuteczność, poświęcając na ten cel dwie dodatkowe transgeniczne myszy: średnio licząc, u zbadanych osobników 94,6% komórek Gal+ było również Cre+, oraz 94,8% komórek Cre+ było również Gal+.

Drugim krokiem było wyhodowanie specjalnego szczepu wirusa AAV (ang. Adeno-Associated Virus), który produkował toksynę błoniczą (ang. diphteria toxin A, DTA) – bardzo silną toksynę powodującą śmierć komórkową, produkowaną naturalnie przez bakterię, maczugowca błonicy – ale tylko w reakcji na kontakt z cząstką białka Cre. Metoda jest następująca: w genomie wirusa odnajduje się geny kodujące białka otoczki, czyli te, które są „oczami i uszami” wirusa. Następnie umieszcza się w tym miejscu gen kodujący antyciało wiążące się z pożądanym białkiem, w tym wypadku Cre. Uzyskany szczep wirusa nosi więc na powierzchni czujnik chemiczny, który aktywuje proces infekcyjny w odpowiedzi na kontakt z pożądanym białkiem.

Myszy transgeniczne Gal-Cre poddawano następnie operacji neurochirugicznej w narkozie, podczas której do obszaru NPOA wpuszczano (po jednej dawce na lewą i prawą stronę ciała) niewielką ilość roztworu zawierającego szczep wirusa AAV-DTA. Po potwierdzeniu, że w efekcie neurony MPOA-Gal+ faktycznie umierają, rozpoczęły się na nowo eksperymenty z zachowaniem wobec osesków.

Zgodnie z założeniami, uzyskano populację myszy dokonujących aktów agresji na oseskach, bez względu na wiek i płeć. Innymi słowy, wszystkie myszy zachowywały się jak młode samce w populacji wyjściowej. Zaobserwowano też efekt ilościowy: wraz z rosnącą liczbą uszkodzonych neuronów NOPA-Gal+ (wirus nigdy nie ma stuprocentowej skuteczności), u samic stopniowo zanikały wszelkiego typu zachowania macierzyńskie, a rosła częstość zachowań agresywnych.

Zabawa przyciskami: włącznik

Skonstruowanie takiego wirusowego „wyłącznika” to kolejny dobry argument, jednak ktoś mógłby wciąż zastanawiać się, czy infekcja wirusowa – nawet precyzyjnie sterowana – nie powoduje szerszych zmian w mózgu, których tylko kolejnym skutkiem ubocznym jest agresja wobec osesków. Jest to niepożądany scenariusz, ponieważ uniemożliwia on wnioskowanie na temat roli obszaru NPOA. Potrzebne było kolejne potwierdzenie.

Naukowcy wyhodowali więc kolejny szczep wirusa AAV, tym razem niegroźny, ale produkujący – w reakcji na kontakt z białkiem Cre (które teraz, jak pamiętamy, służy jako chemiczny znacznik neuronów odpowiedzialnych za zachowania względem osesków)  – białko zwane kanałorodopsyną. Kanałorodopsyna (jest to rzadko używane spolszczenie angielskiego słowa channelrhodopsin, ChR) to białko, które po „zadokowaniu” się w błonie komórkowej pompuje jony przez kanał przechodzący przez środek białka w reakcji na światło o ściśle określonej długości fali. Zmiana stężenia jonów w neuronie powoduje zaś jego „aktywację”, czyli to, co znamy już jako normalną aktywność neuronalną. Myszy Gal-Cre „wzbogacone” o kanałorodopsynę określane są jako Gal::ChR. Myszom Gal::ChR wszczepiono ponadto w mózg włókno światłowodowe, którego jeden koniec był „wycelowany” w obszar MPOA mózgu, a drugi zaopatrzony był we „wtyczkę” dającą się łatwo podłączyć do generatora sygnałów świetlnych (w tym przypadku: światła niebieskiego). (Połączenie narzędzi optycznych z genetycznymi nosi nazwę optogenetyki).

Jest to już poważna ingerencja w mysią anatomię i genetykę, wykonano więc szereg testów sprawdzających, czy tak „zaopatrzone” gryzonie wykazują jakiekolwiek zmiany w zachowaniu lub fizjologii – czy to w odpowiedzi na posiadanie nieaktywnego włókna światłowodowego w mózgu, w reakcji na posiadanie samych modyfikacji genetycznych i tym samym fizjologicznych (teraz już podwójnych: obok dodatkowego białka Cre w błonach neuronów Cre+ występują przecież nowe wrażliwe na światło kanały błonowe), czy też w rezultacie świecenia na normalny, niezmodyfikowany genetycznie obszar MPOA. Otrzymano trzykrotną odpowiedź negatywną – ani modyfikacje genetyczne, ani operacja, ani światłowód wetknięty w mózg, ani nawet świecący światłowód w niezmodyfikowanym genetycznie mózgu nie wydawały się powodować same w sobie żadnej mierzalnej zmiany w myszach.

Przystąpiono wreszcie do ostatecznego eksperymentu. Przed jego opisaniem zbierzmy dla porządku wszystkie fakty w jednym miejscu. Wiadomo, że samce-dziewice wykazują zachowania agresywne wobec mysich osesków. Ustalono, że w momencie dokonywania działań agresywnych w mózgach tych osobników występuje brak aktywności w ściśle określonym obszarze, zwanym przyśrodkowym polem przedwzrokowym (MPOA), przejawiający się najsilniej w grupie neuronów zawierających białko galaninę. Dokonano modyfikacji genetycznej myszek, dzięki której wszystkie neurony z galaniną produkują również białko o nazwie rekombinaza Cre. Myszom z tego szczepu wstrzyknięto w obszar MPOA roztwór zawierający wirusy, które w kontakcie z białkiem Cre produkują kanałorodopsynę, czyli białko „aktywujące” neurony w reakcji na światło. Dokonano następnie operacji wprowadzenie do mózgu włókna światłowodowego, za pomocą którego możliwe jest dostarczanie w dowolnym momencie sygnałów świetlnych do obszaru MPOA.

A teraz opis eksperymentu. Sześciu różnym „zmodyfikowanym” samcom-dziewicom pozwolono na swobodny kontakt z oseskami; w sumie wykonano 19 eksperymentów tego typu, czyli jednemu samcowi pozwolono średnio na kontakt z 3 różnymi oseskami. W 18 przypadkach na 19 skończyło się to zachowaniem agresywnym. Myszy rozdzielano, gdy dochodziło do ataku, czasem już po kilkunastu sekundach. Eksperyment powtórzono, jednak w momencie, gdy samiec dotykał oseska czubkiem nosa, włączano generator. W 18 przypadkach tylko 2 razy doszło do zachowań agresywnych, a ponadto samce wykazywały zachowania pielęgnacyjne, np. czyszczenie ciała albo wylizywanie futra (które u osesków dopiero zaczyna rosnąć) – tego samego typu zachowania, które przejawiają matki, ale też i ojcowie.

myszy2

Ryc. 2. Przebieg dwóch przykładowych prób dla myszy Gal::ChR2 (panel górny, osobniki I i II) oraz myszy kontrolnych (panel dolny, osobniki I i II). Źródło: Wu i in. 2014, Fig. 5f, tłumaczenie własne. Użytek dozwolony.

Dla pewności powtórzono eksperyment z samcami „normalnymi” (bez modyfikacji Gal::ChR) przy zachowaniu wszystkich innych procedur, włącznie w implantacją światłowodu i włączaniem generatora. Bez efektu. Kolejne rundy eksperymentów pokazały ponadto, że stymulacja obszaru MPOA nie wpływa na relacje samców z samicami, w tym też na częstość i skuteczność krycia, natomiast zmniejsza ilość zachowań agresywnych między dorosłymi samcami.

W ten oto sposób, po trwających długie miesiące badaniach, 5 naukowców z Harvardu (plus niezliczona rzesza studentów i postdoców) pokazało, że neurony z galaniną w przyśrodkowym obszarze polu przedwzrokowym zarządzają zachowaniami macierzyńskimi – co zostało następnie opublikowane w „Nature” w artykule o fantazyjnym tytule „Neurony z galaniną w przyśrodkowym obszarze polu przedwzrokowym zarządzają zachowaniami macierzyńskimi”. Ciekawe, ile osób kliknęłoby na ten artykuł, gdyby nosił taki tytuł.

Podsumowanie

Celem tego artykułu było przede wszystkim zwrócenie uwagi na zaplecze technologiczne neuronauk. Przypuszczam, że reakcja na tego typu doniesienia musi mieścić się gdzieś pomiędzy „Ale sprytni ci naukowcy! Co za wspaniały eksperyment! Ile dobra to może przynieść!” a „Ale okrutni ci naukowcy! Co za bezsensowny eksperyment! Ile zła i cierpienia to przynosi!”. Prawdopodobnie uczciwa autoanaliza pokaże, że te dwie składowe mieszają się ze sobą w jednolity koktajl emocjonalny, którego nie rozdzieli żadna technika filozoficzna.

Z zupełnie innej beczki – osobom poważniej zainteresowanym neuronaukami polecam następujące ćwiczenie. Polega ono na ponownym przeczytaniu artykułu i wymyśleniu 10 potencjalnych problemów z opisaną techniką, metodologią i wnioskowaniem. Zapewniam, że po wykonaniu takiej procedury, następnym razem przy czytaniu o kolejnym rewelacyjnym odkryciu „obszaru w mózgu odpowiedzialnego za kradzież” zapali się kilka lampek ostrzegawczych.

* Wu, Zheng et al., „Galanin neurons in the medial preoptic area govern parental behaviour”, Nature 509.7500 (2014): 325-330.

facebook_co_robi

Autor artykułu

Filozof przyrody i dziennikarz naukowy, specjalizuje się w kosmologii, astrofizyce oraz zagadnieniach filozoficznych związanych z tymi naukami. Pracownik naukowy Uniwersytetu Papieskiego...

Dodaj komentarz

Usługodawca nie ponosi odpowiedzialności za treści zamieszczane przez Użytkowników w ramach komentarzy do Materiałów udostępnianych przez Usługodawcę.

Zapoznaj się z Regułami forum

Jeśli widzisz komentarz naruszający prawo lub dobre obyczaje, zgłoś go klikając w link "Zgłoś naruszenie" pod komentarzem.

Zaloguj się albo zarejestruj aby dodać komentarz